本文件规定了对野生动物及其制品的来源进行物种鉴定时样品采集与储存、鉴定程序

　　的构成DNA鉴定程序结果表述追溯方法污染预防与处理实验室区域设置等主要技术要求

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

　　件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

　　4.2.1形态特征完整可分类识别的同类多个检材按照GBZ31233中的简单随机抽样或等距抽样规

　　4.2.2具有部分形态特征可简单分类的多个检材先分类再按照GBZ31233中的简单随机抽样或

　　4.2.3不具有可识别的形态特征的大批量检材先按照GBZ31233中的简单随机抽样或等距抽样规

　　定执行结果出现多个物种时再按照GBZ31233中的分层抽样规定执行物种的个体数量可按鉴定

　　昆虫等小型无脊椎动物可整体取样取适量或整体粉碎收集到离心管或密封袋等储存介质中干

　　应先去除易污染的表层宜采取新鲜洁净的组织或内脏5mm以上收集到离心管或密封袋等储

　　整体送检或清洗后取不少于0.2g骨粉或牙粉组织残留时宜取组织收集到离心管或密封袋等

　　整体送检或清洗后取不少于0.2g粉末等收集到离心管或密封袋等储存介质中干燥常温冷藏

　　注皮肤衍生物是指由皮肤衍生而成的特殊器官如毛羽喙爪蹄角鳞鳍盾片骨板龟甲等

　　宜选新鲜全血采集于EDTA抗凝管或采血卡血痕宜用采样拭子等采集抗凝管和采样拭子等

　　用消毒的镊子或勺等取整颗或在表层和内层各取不低于0.2g收集到离心管或密封袋等储存介质

　　唾液等用消毒的纱布棉花或拭子等采集晾干密封常温保存或者直接密封冷藏或-20℃保存

　　收集足量其他分泌物到离心管或密封袋等储存介质中冷藏保存宜尽快于-20℃保存

　　4.4.1样品宜尽快送检干燥样品常温运输鲜软组织等易腐败的样品应冷藏特殊时干冰冷冻

　　4.4.2每个样品应分别包装在样本袋或容器外标记清楚再将各样品放到统一包装袋或盒中

　　鉴定程序包括个操作步骤检材无形态鉴别特征时有大类方法可选检材具有部分形态

　　新鲜皮张等去除表层剪碎或研磨干燥皮张等应先用乙醇或去离子水等清洗次次缓冲

　　依据检材类型和DNA物种鉴定目标确定DNA提取方法应设置空白对照并严防交叉污染

　　适用于组织血液等样品量充足的检材毛羽等微量检材以及粪便等检材应严格按照说明书

　　应严格设置阴性对照不加DNA的空白对照与阳性对照已知物种的DNA样品必要时

　　确定目标区域如DNA条形码Ctb基因等选择通用引物见附录B按照反应体系和反应程

　　序见附录进行扩增电泳检测见附录有扩增产物且与预期大小一致则纯化按纯化试剂

　　比对得到序列一致性结果或在数据库中进行序列比对选取一致性最高的序列及其他近缘物种的同

　　注多个数据库综合比对包括但不限于自建标准数据库国家动物核酸数据库以及各专项数据库国际的BOLD

　　a与单一物种一致性最高且≥99%判定与已知物种一致判定该检材来源于×××物种

　　b与两个及以上物种一致性最高且≥99%应加测基因或判定该检材来源于×××物种

　　c与单一物种一致性最高且在90%~99%之间应加测基因如仍未达到99%应谨慎判定

　　d或进化树中位于同一单系分支且置信值达80%以上的物种即为检材所属物种判定该检材

　　e因为检材质量原因未获得有效DNA或缺乏比对的标准序列判定无法判定或无法确定

　　应严格设置阳性对照已知物种的DNA样品即检材疑似物种的DNA样品和阴性对照近缘物

　　选择目标区域如DNA条形码Ctb基因等并选择根据物种特异位点设计的物种特异性引

　　物确定反应体系和反应程序见附录D进行PCR扩增扩增产物进行电泳检测见附录A

　　a检材与阳性对照有扩增产物产物的大小与DNA分子量标准比对时与预期大小一致且阴性

　　b阳性对照有扩增产物且产物的大小与DNA分子量标准比对时与预期大小一致检材和阴性

　　对照均无扩增产物或者检材扩增产物与预期大小不一致则表示结果阴性判定为未检

　　c检材阳性对照和阴性对照均有扩增产物且产物的大小与DNA分子量标准比对时与预期大

　　应严格设置阳性对照已知物种的DNA样品即检材疑似物种的DNA样品阴性对照非疑似物

　　种的DNA和空白对照提取时设置的提取空白对照和以无菌去离子水代替DNA模板的PCR空白对

　　根据选择的目标区域如DNA条形码Ctb基因等选择物种特异性引物和荧光探针确定反应

　　本应根据实际情况调整基线范围阈值设置原则以基线刚好超过正常空白对照扩增曲线无规则的噪

　　对照扩增正常含内参基因时检测结果也为阳性判定该样品检出×××物种DNA成

　　对照扩增正常含内参基因时检测结果也为阳性可加倍DNA模板量重复试验如果Ct

　　值减小并拥有明显扩增曲线阳性对照阴性对照和空白对照依然扩增正常含内参基因时检

　　根据选择的目标区域如DNA条形码Ctb基因等选择物种特异性引物和荧光探针确定反应

　　“怎么提升在九游娱乐的游戏体验？”

　　反应有荧光信号为阳性无荧光信号为阴性软件记录每个样品的阳性和阴性数正确度偏差不应

　　“怎么提升在九游娱乐的游戏体验？”

　　a阳性对照阴性对照和空白对照扩增正常检材阳性判定该检材检出×××物种DNA成

　　b阳性对照阴性对照和空白对照扩增正常检材阴性判定该检材未检出×××DNA成分

　　根据预判的物种范围和选择的目标基因选择物种特异性引物或通用引物确定反应体系和反应程

　　序见附录C进行PCR扩增电泳检测若扩增产物片段大小正确则进行下一步酶切反应

　　酶解产物进行电泳检测酶切片段数量和大小与目标物种预期一致判定该检材为检出×××物

　　种DNA成分或来源于×××物种否则判定该检材未检出×××物种DNA成分若有

　　疑问可更换方法验证因为检材质量原因无法获得有效DNA判定无法判定或无法确定具体物种

　　环介导等温扩增技术重组酶聚合酶扩增技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术等方法应经专家

　　注等温扩增法是一类分子生物学技术的总称在某一特定的温度下扩大核酸的拷贝数

　　基于文库构建方法选择使用合适的测序平台进行全基因组测序应严格把控测序质量测序质

　　注全基因组测序是指对生物检材进行整个基因组测序包括长读长测序和短读长测序用以获得物种完整的基因

　　待测样本与其他物种进行序列的比较分析时如构建系统进化树等应选取各物种中的同源区域

　　选取疑似物种或其近缘物种的高质量基因组作为参考基因组将待测个体与其他候选物种的测序

　　数据比对到参考基因组上进行遗传变异的检测筛选出高质量SNP单核苷酸多态性位点通过物种

　　结果与目标物种预期相符判定该检材检出×××物种DNA成分或来源于×××物种否

　　则判定该检材未检出×××物种DNA成分或非来源于×××物种因为检材质量原因无法获

　　芯片法以及利用新技术开发的DNA物种鉴定方法经同行专家组评估验证后形成标准程序可

　　具有部分形态鉴别特征的检材上述DNA结果可以结合形态学特征综合判断还可以结合地理分

　　称取1g琼脂糖置于200mL锥形瓶中加入100mL1×TAE稀释缓冲液放入微波炉加热至琼

　　溶液使其终浓度为110000根据染料不同可调整轻轻摇匀也可取1L~2L染料工作

　　液和5L电泳样品混匀静置5min直接上样慢慢地倒入胶槽内使胶液形成均匀的胶层

　　c室温下静置30min~45min待琼脂糖溶液完全凝固垂直拔出样品梳注意不要损伤梳底部

　　取9L检测样品与1L110体积的10×DNA上样缓冲液混匀用微量移液器小心加入样品

　　接通电泳仪电源按照需要调节电压电泳开始观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝有气泡出

　　新能源集控中心项目 智慧电厂建设项目 智慧光伏 智慧水电 智慧燃机 智慧工地 智慧城市 数据中心 电力行业信息化

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